ED Sciences de la Vie et de la Santé
Imagerie de super-résolution par localisation de molécules uniques en profondeur dans des modèles 3D multicellulaires à l'aide d'optique adaptative et de façonnage de PSF
par Laetitia BETTAREL (Institut Interdisciplinaire de Neurosciences)
Cette soutenance a lieu à 14h00 - Amphithéatre Centre Broca Centre Broca Nouvelle Aquitaine IINS - UMR 5297 - Bât. Neurocampus 146 rue Léo Saignat
devant le jury composé de
- Rémi GALLAND - Chargé de recherche - Université de Bordeaux - Directeur de these
- Lydia DANGLOT - Chargée de recherche - Institut de Psychiatrie et de Neurosciences de Paris (IPNP) - INSERM - Rapporteur
- Alexandra FRAGOLA - Professeure des universités - Institut des Sciences Moleculaires d'Orsay (ISMO) - Rapporteur
- Laurent COGNET - Directeur de recherche - Laboratoire Photonique, Numérique et Nanosciences (LP2N) - Examinateur
L'évaluation de l'organisation et de la dynamique des protéines dans leur contexte cellulaire natif fournit des informations clés sur les mécanismes moléculaires qui gouvernent le fonctionnement cellulaire. La microscopie de super-résolution fut une avancée majeure à cet égard, permettant d'importantes découvertes en biologie cellulaire, développementale et en neurobiologie. Parmi ces techniques, la microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) permet de localiser, suivre et compter ces biomolécules dans leur environnement cellulaire avec une résolution nanométrique. Cependant, l'imagerie SMLM conventionnelle est limitée par sa faible profondeur de pénétration, empêchant ainsi l'étude de nombreux processus biologiques. Réaliser de la SMLM en profondeur au sein d'échantillons multicellulaires complexes pose donc plusieurs défis : obtenir un sectionnement optique efficace tout en conservant une bonne collection de photons, et corriger les aberrations optiques introduites à la fois par le système et par l'échantillon, qui brouillent les signaux des molécules uniques et compromettent la précision et la justesse de la localisation de ces dernières. Pour relever ces défis, nous avons développé au sein de l'équipe un microscope à feuille de lumière, appelée soSPIM, qui permet l'imagerie en profondeur de molécules uniques. En parallèle, l'optique adaptative (AO) est devenue une solution puissante pour corriger les aberrations induites par le système et/ou l'échantillon et ainsi améliorer la qualité d'image en profondeur. Récemment, nous avons combiné le soSPIM avec l'AO afin de réaliser de l'imagerie 3D SMLM en profondeur à l'échelle des cellules entières. Toutefois, cette implémentation repose encore sur des marqueurs fiduciaires situés à proximité de l'échantillon, ce qui ne permet pas la correction des aberrations induites par l'échantillon lui-même, qui sont particulièrement significatives dans les systèmes multicellulaires. De plus, elle utilise des approches de localisation 3D conventionnelles, non optimales pour une localisation rapide et précise de molécules uniques en profondeur. Dans ce contexte, mes travaux de thèse se sont concentrés sur le développement de solutions méthodologiques cherchant à étendre l'applicabilité de la plateforme d'imagerie AO-soSPIM à la SMLM en profondeur dans des échantillons 3D complexes. Dans un premier temps, j'ai développé un algorithme d'AO entièrement personnalisé en Python, permettant un contrôle complet de tous les paramètres de la boucle de correction, y compris dans le choix de métriques définies par l'utilisateur et spécifiquement adaptées à la modalité d'imagerie et au type d'échantillon. À partir de cela, j'ai établi un cadre systématique pour évaluer des métriques basées sur les images SMLM sans fiduciaires et d'identifier les plus sensibles et robustes dans notre contexte expérimental. Dans un second temps, j'ai exploré des méthodes de localisation de molécules uniques basés sur l'apprentissage profond, exploitant des modèles de PSFs expérimentales afin d'améliorer à la fois la robustesse de la localisation et la vitesse d'imagerie. Cette approche offre une alternative prometteuse aux méthode conventionnelle par ajustement gaussien dans des régimes SMLM 3D denses. J'ai également étudié des stratégies de modélisation expérimentale de la PSF pour mieux prendre en compte les aberrations résiduelles et les déformations complexes de la PSF en profondeur. Ces approches visent à améliorer la précision et la justesse de localisation des molécules individuelles dans des conditions extrêmes à l'intérieur d'échantillons complexes. Dans l'ensemble, ces développements méthodologiques établissent un pipeline robuste pour la SMLM 3D corrigée au sein d'échantillons biologiques complexes. Ce travail vise ainsi à élargir le champ d'application de la microscopie SMLM vers des modèles 3D à la pertinence physiologique accrue tels que les sphéroïdes et les organoïdes.
Identification des cellules souches leucémiques de la leucémie myéloïde chronique dans un nouveau modèle murin
par Yasmine TAVEAU (BoRdeaux Institute of onCology)
Cette soutenance a lieu à 14h00 - Salle de Conférence Centre d'Appui à la Recherche et de Formation (CARF) 146 rue Léo Saignat 33000 Bordeaux
devant le jury composé de
- Béatrice TURCQ - Chargée de recherche - Université de Bordeaux - Directeur de these
- Bastien GERBY - Directeur de recherche - Centre de Recherches en Cancérologie de Toulouse (CRCT) - Rapporteur
- Franck-Emmanuel NICOLINI - Praticien hospitalier - Centre Léon Bérard - Rapporteur
- Stéphane PROST - Directeur de recherche - CEA Fontenay-aux-Roses - Examinateur
- Katia BONIFACE - Professeur - Université de Bordeaux - Examinateur
La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif initié lorsqu'une cellule souche hématopoïétique (CSH) acquiert l'oncogène de fusion BCR::ABL1 suite à une translocation chromosomique entre les chromosomes 9 et 22. Cet oncogène code la protéine BCR::ABL1, une tyrosine kinase constitutivement active, responsable d'une prolifération pathologique de la lignée granuleuse. La LMC commence par une phase chronique qui peut durer plusieurs années, et en l'absence de traitement, la maladie progresse vers une phase accélérée puis une crise blastique. Le développement des inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) a révolutionné le traitement de la maladie, proposant une thérapie ciblée visant les cellules exprimant BCR::ABL1. Les résultats spectaculaires de cette nouvelle classe thérapeutique ont même amené les cliniciens à proposer des tentatives d'arrêt de traitement chez les patients en réponse moléculaire profonde. Malheureusement plus de 50 % des patients rechutent à l'arrêt du traitement en raison de la persistance des cellules souches leucémiques (CSL), ne permettant pas encore de "guérir" cette maladie. L'identification et la caractérisation des CSL, ainsi que les mécanismes de leur persistance, restent encore mal compris faute de modèles pertinents. Afin de caractériser les CSL responsables des rechutes, un modèle préclinique de phase chronique de la LMC a été établi. Ce nouveau modèle murin, Pdzk1ip1-CreERTg/+ TRE-BCR-ABL1Tg/+ R26rtTA-GFP/Tom (ci-après Cre+ BA+), permet l'expression inductible du transgène BCR::ABL1 dans une fraction de CSH. L'expression différentielle de marqueurs fluorescents permet de suivre les cellules hématopoïétiques normales par rapport aux cellules BCR::ABL1+. Contrairement aux modèles existants, ce modèle reproduit les principales caractéristiques de la LMC humaine, notamment une longue phase chronique, et permet l 'étude des CSL. Afin d'identifier les cellules initiatrices de la maladie, qui sont probablement responsables de rechutes à l'arrêt des traitements, des tests fonctionnels de transplantation des différentes populations de cellules leucémiques Tom+ GFP+ issues soit de la moelle osseuse soit de la rate d'animaux Cre+ BA+ ont été effectués. Seules les cellules présentant un phénotype de CSH (Lin- Sca1+ cKit+ CD150+ CD48-) sont capables d'initier la maladie chez les souris receveuses. Parallèlement, l'induction de l'expression de BCR::ABL1 chez des animaux Cre+ BA+ entraine l'apparition des symptômes de la LMC. Les animaux ont ensuite été traités par administration quotidienne de dasatinib, un ITK de deuxième génération. Après 30 à 40 jours de traitement une diminution des granulocytes Tom+ GFP+, une normalisation des plaquettes et des globules blancs, ainsi qu'une diminution des transcrits BCR::ABL1 ont été observés . Après 50 jours, le traitement a été arrêté et chez la majorité des souris les symptômes de la maladie sont réapparus, démontrant la persistance de cellules capables de réinitier la maladie et la pertinence de ce modèle pour l'étude des cellules responsables des rechutes lors des tentatives d'arrêt de traitement dans la LMC. Afin d'explorer les mécanismes de régulation des cellules persistantes, une analyse transcriptomique unicellulaire sur des cellules souches hématopoïétiques Tom+ GFP+ (Lin- cKit+ Tom+ GFP+) a été réalisée et a permis d'identifier des altérations de l'expression génique et des voies biologiques spécifiques, ainsi que des gènes marqueurs de ces cellules. L'identification et la caractérisation des CSL pourraient révéler de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d'envisager une solution réellement curative de la LMC. Le développement de ce modèle murin préclinique reproduisant l'initiation et la phase chronique de la maladie constitue un atout majeur pour l'étude de ces cellules et l'élaboration de traitements innovants.
RESTRICTION DÉPENDANTE DE L'ÂGE DE L'INFECTION À ADÉNOVIRUS DANS L'ÉPITHÉLIUM BRONCHIQUE PRIMAIRE
par Anastasiia TYMCHENKO (Microbiologie fondamentale et Pathogénicité)
Cette soutenance a lieu à 14h00 - Module 1.1 146 Rue Léo Saignat, bât CROUS 1er étage, 33000, Bordeaux
devant le jury composé de
- Goujon CAROLINE - Directrice de recherche - Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier - Rapporteur
- Ehrhardt ANJA - Full professor - Witten/Herdecke University - Rapporteur
- Johan GARAUDE - Associate Professor - University of Bordeaux - Examinateur
- Julie DéCHANET-MERVILLE - Directrice de recherche - University of Bordeaux - Examinateur
Les adénovirus sont des virus respiratoires infectant principalement les voies supérieures, généralement responsables de symptômes bénins grâce au contrôle immunitaire établi dès l'enfance. Toutefois, certains génotypes induisent des infections respiratoires sévères, associées à une forte libération de cytokines pro-inflammatoires. Cette thèse vise à comprendre comment les infections à adénovirus se propagent dans l'épithélium bronchique (EB), quels mécanismes intrinsèques contrôlent cette propagation et comment elles induisent une protection croisée contre d'autres virus respiratoires. Nous avons établi un modèle primaire d'EB dérivé de brossages pulmonaires de donneurs adultes et pédiatriques, cultivé à l'interface air-liquide. À l'aide d'adénovirus de type C (récepteur CAR) et de type B (récepteur DSG2), nous avons suivi la propagation virale grâce à des virus marqués génétiquement, des isolats cliniques, l'imagerie cellulaire et la microscopie confocale. Nous avons mesuré l'intégrité épithéliale et la libération apicale/basolatérale du virus. L'analyse scRNA-seq a permis de caractériser la réponse transcriptionnelle au pic d'infection. Les infections progressent à partir de foyers locaux évoluant en lésions macroscopiques, associées à une diminution de la résistance électrique transépithéliale, traduisant une perte d'intégrité. La propagation est d'abord apicale, puis basolatérale après destruction de l'épithélium. Aucune différence notable n'a été observée entre EB adultes et pédiatriques. Les données suggèrent que les foyers endommagent progressivement l'EB, permettant la diffusion transépithéliale. Au niveau transcriptionnel, l'infection induit une sous-population cellulaire marquée par FAM111B, facteur de restriction viral putatif. Le séquençage unicellulaire a montré une forte induction de la signalisation interféron et une régulation accrue des gènes stimulés par l'interféron (ISG). Nous avons ensuite exploré la protection croisée. Les EB adultes et pédiatriques ont été infectés par trois virus respiratoires distincts : adénovirus, rhinovirus A (RVA) et C (RVC). Nous avons comparé leurs cinétiques de réplication, réponses immunitaires innées et morphologies d'infection, puis caractérisé la réponse transcriptionnelle par scRNA-seq. Pour tester la protection croisée, les EB pré-infectés ont été réexposés au RVA exprimant un gène GFP. Dans tous les cas, une protection croisée a été observée, avec des cinétiques variables selon le virus initial. Le séquençage global de l'ARN a identifié un ensemble distinct d'ISG associés à cette protection, notamment IFI44L, dont le rôle antiviral reste peu connu. Ces résultats suggèrent que certains ISG, en particulier IFI44L, pourraient jouer un rôle central dans la protection croisée et représenter de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer l'immunité antivirale des voies respiratoires.
ED Sociétés, Politique, Santé Publique
Méthodes de régularisation pour l'intégration de données de grande dimension dans les modèles mécanistes : application pour le développement de vaccins.
par Auriane GABAUT (Bordeaux Population Health Research Center)
Cette soutenance a lieu à h00 - Amphi PA Louis ISPED, Université de Bordeaux - Campus Carreire, 146 Rue Léo Saignat, 33000 Bordeaux
devant le jury composé de
- Mélanie PRAGUE - Chargée de recherche - Université de Bordeaux - Directeur de these
- Emmanuelle COMETS - Chargée de recherche - INSERM Paris - Rapporteur
- Julien CHIQUET - Directeur de recherche - Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech - Rapporteur
- Pierre NEUVIAL - Directeur de recherche - CNRS, Institut de Mathématiques de Toulouse - Examinateur
- Sébastien BENZEKRY - Chargé de recherche - Inria Sophia-Antipolis , Inserm U1068, CNRS UMR7258 - Examinateur
- Cécile PROUST-LIMA - Directrice de recherche - Bordeaux Population Health Research Center, Inserm, Université de Bordeaux - CoDirecteur de these
- Hélène JACQMIN-GADDA - Directrice de recherche - Bordeaux Population Health Research Center, Inserm, Université de Bordeaux - Examinateur
La vaccination est hautement efficace pour prévenir les maladies infectieuses, mais la réponse immunitaire aux vaccins varie considérablement d'un individu à l'autre, et les mécanismes sous-jacents ne sont pas entièrement compris. La modélisation mathématique a le potentiel d'améliorer notre compréhension des réponses immunitaires induites par les vaccins. Cependant, cela nécessite de nouvelles méthodes pour traduire des observations complexes, bruitées, incomplètes et de grande dimension en modèles mécanistes. Cette thèse s'inscrit dans cette perspective et propose de nouvelles méthodes visant à intégrer des marqueurs de grande dimension, comme les données transcriptomiques, à des processus décrits par des modèles mécanistes basés sur des équations différentielles ordinaires, représentant les processus cellulaires sous-jacents impliqués dans la réponse immunitaire à la vaccination. L'hétérogénéité interindividuelle est modélisée à l'aide d'effets mixtes appliqués aux paramètres du modèle mécaniste. L'intégration de ces données repose sur des techniques de régularisation adaptées à la haute dimension. Le premier axe de la thèse s'intéresse à l'intégration de marqueurs transcriptomiques mesurés à un temps fixe, utilisés comme variables explicatives de la variabilité interindividuelle dans les paramètres du modèle mécaniste. La méthode développée repose sur un algorithme itératif combinant régression pénalisée de type Lasso et estimation des paramètres par l'algorithme SAEM, afin de construire un modèle final parcimonieux et interprétable. Le second axe vise à intégrer des données transcriptomiques longitudinales. Il repose sur l'hypothèse que certains biomarqueurs - en particulier les profils d'expression génique - reflètent l'évolution de compartiments non observés du modèle mécaniste, tels que des populations cellulaires. Un algorithme de descente par coordonnées est proposé, alternant entre régularisation Lasso des biomarqueurs et estimation des paramètres de population via SAEM, dans le but de maximiser une vraisemblance jointe pénalisée. Cette approche permet d'effectuer simultanément la sélection des marqueurs associés aux compartiments et l'estimation des paramètres du modèle. Ces deux contributions ont donné lieu à des paquets R accessibles sur le CRAN ou GitHub. Les méthodes proposées sont appliquées à des données d'essais vaccinaux contre Ebola, la varicelle et le SARS-CoV-2, afin d'identifier quels marqueurs transcriptomiques décrivent le mieux le processus d'établissement de la réponse immunitaire après vaccination. La méthodologie développée peut être plus largement appliquée à d'autres processus biologiques complexes, y compris dans des pathologies comme le cancer, pour lesquels des modèles mécanistes et des données de grande dimension sont disponibles.