ED Sciences de la Vie et de la Santé
Résistance aux antibiotiques de dernier recours chez Pseudomonas aeruginosa et nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques
par Léa BIENTZ (Microbiologie fondamentale et Pathogénicité)
Cette soutenance a lieu à 9h30 - « Salle de conférence » Le Centre d'Appui à la Recherche et à la Formation (CARF) Site Carreire de l'Université de Bordeaux 146, rue Léo Saignat 33076 Bordeaux cedex.
devant le jury composé de
- Véronique DUBOIS - Professeure des universités - praticienne hospitalière - Université de Bordeaux - Directeur de these
- Katy JEANNOT - Professeure des universités - praticienne hospitalière - Université de Franche-Comté - Rapporteur
- Thierry NAAS - Maître de conférences - praticien hospitalier - Université Paris-Saclay - Rapporteur
- Marie-Cécile PLOY - Professeure des universités - praticienne hospitalière - Université de Limoges - Examinateur
- Laurent STECKEN - Praticien hospitalier - CHU Bordeaux - Examinateur
La résistance aux antibiotiques (ATB) est un problème majeur de santé publique. Dans ce contexte, Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste principalement nosocomiale et multi-résistante, est considérée comme une bactérie de priorité élevée pour la surveillance, la recherche et le développement de nouveaux ATB. L'objectif de ce travail était d'étudier chez P. aeruginosa les mécanismes de résistance au ceftolozane-tazobactam (C/T) et aux carbapénèmes qui sont des ATB de dernier recours, et d'étudier de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques. Pour ce travail, nous avons bénéficié de l'apport des données du séquençage haut débit dans le cadre du projet international MAGITICS (MAchine learning for diGItal diagnosTICS of antimicrobial resistance). Au total, 319 souches de P. aeruginosa ont été sélectionnées pour leurs profils de résistance variés. Quatre-vingt-cinq séquences types (ST) différentes ont été retrouvées, et 38,9% des souches appartenaient à un clone épidémique à haut risque. Onze gènes chromosomiques impliqués dans la résistance ont été analysés, notamment, le gène oprD, impliqué dans la résistance aux carbapénèmes, qui était modifié dans 43,9% des souches, dont 35% par la présence d'une séquence d'insertion. Des gènes codant pour une β-lactamase et/ou pour une enzyme modificatrice des aminosides, ont été acquis chez 119 souches dont 87% étaient associés à un intégron. Les résultats préliminaires de la prédiction des CMI (concentration minimale inhibitrice) à partir des génomes ont montré une précision entre 64,6% et 85,1% selon l'antibiotique (ceftazidime, imipénème, amikacine et ciprofloxacine). Les analyses métabolomiques ont mis en évidence une différence significative des métabolites présents entre souche sensible et souche isogénique résistante. Grâce à l'obtention des données génomiques nous avons pu suivre l'apparition de résistance pour 9 patients sur 50 traités par C/T (18%) sur une période de 13 mois. Cette résistance était toujours associée à la présence de mutations (T70I, F121L, P154L, G157D, P217Q, E221K et del210-216) dans le site actif de la céphalosporinase chromosomique AmpC. Certains patients présentaient des isolats différents avec des mutations diverses en lien avec des souches hypermutatrices. Des expériences de clonage dans une souche déficiente en AmpC ont permis d'évaluer le niveau de résistance au C/T pour chaque mutation, et leur impact sur les nouveaux ATB. L'ensemble des mutations, sauf F121L et P154L, entraînait un haut niveau de résistance au C/T et permettait la restauration de la sensibilité à l'imipénème. Une autre étude portant sur 8 souches cliniques productrices de la carbapénémase IMP-13, nous a permis de montrer pour la première fois, que le gène blaIMP-13 était porté par un ICE (élément intégratif et conjugatif) fonctionnel grâce à des expériences de conjugaison. Cet ICE de 88589 pb, de la famille des ICEclc, s'insérait en 3' de l'ARNtGly PA0729.1. Cette mobilisation s'accompagnait d'une variabilité en 3' de l'ICE avec transfert de gènes adjacents présents sur la souche donatrice. Ainsi, même si la diffusion de blaIMP-13 est principalement liée au clone épidémique ST621, la mobilisation de l'ICE est possible et ne doit pas être sous-estimée. Enfin, nous avons étudié une nouvelle approche thérapeutique en utilisant des nanobodies (Nbs) dirigés contre la protéine OprM impliquée dans plusieurs systèmes d'efflux responsables de résistances. Ainsi, certains Nbs stoppaient la croissance bactérienne et restauraient l'activité de l'ATB efflué. Des peptidomimétiques basés sur le paratope des Nbs pourraient ainsi représenter une nouvelle classe d'inhibiteurs de pompe d'efflux. Ce travail a ainsi contribué à améliorer la compréhension des mécanismes de résistance aussi bien chromosomique que par transfert horizontal de gènes, mais a également permis d'aborder des nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques prometteuses dans la lutte contre l'antibiorésistance.
Évolution dirigée et ingénierie de protéine pour l'étude des mécanismes moléculaires de la transmission synaptique
par Ivana TRIVUNOVIC (Institut Interdisciplinaire de Neurosciences)
Cette soutenance a lieu à h00 - Amphi Centre Broca Nouvelle - Aquitaine Centre Broca Nouvelle-Aquitaine 146 rue Leo Saignat 33077 Bordeaux France
devant le jury composé de
- Matthieu SAINLOS - Directeur de recherche - Université de Bordeaux - Directeur de these
- Nathalie SANS - Directrice de recherche - Université de Bordeaux - Examinateur
- Gerti BELIU - Chargé de recherche - University of Würzburg - Rapporteur
- Arnaud GAUTIER - Professeur des universités - University of Sorbonne - Rapporteur
Au cours des dernières décennies, les avancées technologiques ont permis de générer une vision plus précise de l'organisation complexe du cytosquelette neuronal et des synapses. Ces progrès vont du développement significatif de différentes techniques d'imagerie aux outils moléculaires actuellement utilisés pour sonder différents compartiments cellulaires et des protéines spécifiques dans les synapses excitatrices. Malgré ces progrès, notre compréhension d'un certain nombre d'éléments structurels et fonctionnels de ces compartiments neuronaux spécialisés est encore incomplète. Les outils développés précédemment, tels que les anticorps synthétiques et les protéines de fusion, doivent encore être améliorés pour parvenir à un sondage structurel et fonctionnel précis et à la modulation des protéines endogènes. Le travail de cette thèse a été consacré à l'exploitation des techniques d'ingénierie des protéines pour obtenir des bibliothèques génomiques hautement diversifiées en utilisant la mutagenèse dirigée et le criblage à haut débit. Ceci permet d'appliquer une pression évolutive sur des bibliothèques contenant des milliards de séquences afin d'identifier les meilleurs candidats liants basés sur le domaine de la 10ème fibronectine humaine. La conception et la sélection de bibliothèques intra-corps se sont concentrées sur deux protéines du cytosquelette, les talines et les spectrines, responsables du développement neuronal ainsi que de la formation et de la stabilisation des synapses. La taline joue un rôle essentiel dans la communication cellulaire avec la matrice extracellulaire et dans le maintien de la stabilité et de l'intégrité cellulaires globales. Elle contient deux domaines fonctionnels distincts, le N-term de FERM et le domaine de tige de la taline. Dans le cadre de ce travail, nous rapportons trois liants hautement spécifiques aux sous-domaines de tige de la taline R1R2, R9 et R11. Les complexes de ces liants avec leurs domaines cibles ont été caractérisés par RMN 2D, fournissant un aperçu détaillé des épitopes de liaison des domaines cibles. Les spectrines créent un réseau protéique très régulier avec des anneaux d'actine à travers la cellule, s'étendant du segment initial de l'axone aux épines dendritiques. Dans ce contexte, de petits domaines de αII-spectrine et de β(II-IV)-spectrine ont été ciblés dans nos sélections, ce qui a donné lieu à plusieurs candidats prometteurs pour l'étude structurelle et fonctionnelle des spectrines. La modulation des interactions protéine-protéine a été axée sur l'inhibition de plusieurs protéines de la région de la densité post-synaptique, impliquées dans le trafic des récepteurs du glutamate, la stabilisation des synapses et la transduction des signaux, afin qu'elles ne se lient pas aux domaines PDZ de PSD95. Cette approche de l'inhibition protéine-protéine du domaine PDZ permettra de bloquer une seule des nombreuses interactions du domaine PDZ et de mieux comprendre la contribution de chaque interaction médiée par le domaine PDZ dans la régulation complexe de la plasticité synaptique. Après une caractérisation complète, ces intrabodies et ces pinces d'affinité fourniront un nouvel ensemble d'outils génétiquement codés pour le marquage et la modulation des protéines endogènes.