ED Sciences Chimiques
Approches de chémobiologie pour quantifier la S-acylation des protéines
par Chloé FREYERMUTH--REYMOND (Institut de Chimie & de Biologie des Membranes & des Nano-objets)
Cette soutenance a lieu à 9h00 - Amphithéâtre IECB, 2 Rue Robert Escarpit 33607 PESSAC FRANCE
devant le jury composé de
- Emmanuelle THINON - Chargée de recherche - Chimie et Biologie des Membranes et Nanoobjets (CBMN) - Directeur de these
- Laurence ABRAMI - Maîtresse de recherche - Ecole polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL) - Rapporteur
- Edward TATE - Professor - Imperial College London - Rapporteur
- Agnès RöTIG - Directrice de recherche - Institut Imagine - Examinateur
- Frédéric FRISCOURT - Associate Professor - Institut des Sciences Moléculaires (ISM) - Examinateur
- Gilles GUICHARD - Directeur de recherche - Chimie et Biologie des Membranes et Nanoobjets (CBMN) - Examinateur
La S-acylation est une modification post-traductionnelle des protéines qui correspond à la formation d'une liaison covalente entre un acide gras et un résidu cystéine. L'ajout de ce groupement hydrophobe peut modifier la localisation des protéines et affecter leur structure et/ou leur stabilité. La réversibilité et le dynamisme de cette modification enzymatique lui confèrent un rôle de régulateur dans les cellules, avec une implication observée dans de nombreux processus biologiques importants. Des aberrations dans les cycles de S-acylation ont été associées à différentes maladies humaines, telles que des cancers ou des maladies neurodégénératives. Les méthodes de protéomique existantes reposent principalement sur la quantification relative de la S-acylation des protéines. Notamment, il n'existe pas de méthodes permettant de quantifier précisément les variations des niveaux de S-acylation de chaque cystéine. Ce projet de thèse s'est concentré sur le développement d'une méthode de quantification de la S-acylation des cystéines dans un seul échantillon de protéome. Nous avons choisi de baser la méthode sur le marquage séquentiel et différentiel des cystéines libres et des cystéines S-acylées à l'aide d'une paire de sondes chimiques marquées isotopiquement. Les sondes ont des structures identiques, composées d'un électrophile pour alkyler les cystéines, d'une fonction alcyne, et d'isotopes légers et lourds permettant d'introduire une différence de masse (sonde « légère » (12C, 14N) et sonde « lourde » (13C, 15N)). Les cystéines marquées sont ensuite couplées par réaction click à un agent de capture portant un motif biotine et un azoture. Après digestion par la trypsine, les peptides contenant des cystéines sont enrichis à l'aide de billes de NeutrAvidin. Suite à leur élution des billes, les peptides marqués sont analysés par LC-MS/MS. L'analyse MS fournit un ratio de marquage lourd/léger pour les cystéines marquées dans un seul échantillon de protéome, révélant le pourcentage de S-acylation de ces cystéines. Les outils chimiques (sondes et agents de capture) ont été synthétisés et le pipeline a été développé, avec la sélection des différents paramètres des étapes de traitement des protéines à l'aide d'analyses qualitatives (Western blot). Des analyses par protéomique ont ensuite permis d'étudier plus en détail des variables, telles que les couples de sondes et d'agents de capture, les paramètres d'analyse LC-MS/MS et le traitement des données pour calculer les pourcentages de S-acylation. La méthode a été appliquée pour détecter les changements des niveaux de S-acylation suite à un stimulus externe, permettant l'acquisition de nouvelles informations sur certaines voies de signalisation et des processus biologiques associés. Les optimisations de la méthode seront poursuivies, notamment avec la comparaison de sondes possédant de nouvelles structures et une automatisation du pipeline. Nous prévoyons une large application de la méthode développée à l'étude des niveaux de S-acylation des cystéines des protéines et de leur lien avec différentes pathologies, ce qui pourrait révéler des traitements innovants.
ED Sciences de la Vie et de la Santé
ACTION DES RECEPTEURS 5-HT2A SUR LES SYSTEMES DE NEUROTRANSMETTEURS DANS LE CERVEAU DE SOURIS: APPLICATION AUX PSYCHEDELIQUES.
par Jasmine BUTLER (Institut de neurosciences cognitives et intégratives d'Aquitaine)
Cette soutenance a lieu à 14h00 - Amphithéatre (BBS - Salles RDC) Laboratoire INCIA - CNRS - UMR 5287 Bâtiment BORDEAUX BIOLOGIE SANTE 2 rue Docteur Hoffman Martinot BP 22 33076 Bordeaux cedex
devant le jury composé de
- Philippe DE DEURWAERDERE - Full professor - Université de Bordeaux - Directeur de these
- Muriel DARNAUDERY - Full professor - Université de Bordeaux - Examinateur
- Carine BÉCAMEL - Docteure - Université de Montpellier - Rapporteur
- Mickael NAASSILA - Full professor - Université de Picardie Jules Verne (UPJV) - Rapporteur
- Nasser HADDJERI - Directeur de recherche - Université Claude Bernard Lyon 1 - Examinateur
Le sous-type de récepteur de la sérotonine 2A (5-HT2AR) suscite un grand intérêt suite aux recherches clinique et préclinique sur les psychédéliques sérotoninergiques. Ces composés ont une action agoniste convergente sur le 5-HT2AR et ont des propriétés antidépressives et anxiolytiques. Cet intérêt s'ajoute à des données antérieures montrant que l'antagonisme du récepteur 5-HT2AR, qui fait partie du profil pharmacologique des antipsychotiques atypiques, pourrait avoir des effets bénéfiques dans plusieurs pathologies dont la schizophrénie. Néanmoins, l'impact des 5-HT2AR sur le fonctionnement cérébral, en particulier sur la neurotransmission, est peu connu. Les réseaux cérébraux fonctionnels ont été conceptualisés en corrélant des signaux électriques ou métaboliques entre les régions du cerveau grâce à l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle ou l'encéphalographie. Ces études de neuroimagerie ont montré que les psychédéliques modifient la connectivité de réseaux cérébraux mais elles ne peuvent pas évaluer la neurochimie des systèmes de neurotransmetteurs et leur interaction. Cette thèse aborde l'hypothèse selon laquelle les agonistes 5-HT2AR psychédéliques perturbent l'organisation fonctionnelle des systèmes de neurotransmetteurs à l'échelle du cerveau. Le contenu tissulaire des neurotransmetteurs classiques (glutamate et GABA) et monoaminergiques (sérotonine, dopamine et noradrénaline) et de leurs métabolites a été mesuré dans 28 régions du cerveau de souris après l'administration d'un agoniste et d'un antagoniste 5-HT2AR de haute affinité, le TCB-2 et le MDL100,907, respectivement. Pour promouvoir une organisation cohérente des systèmes de neurotransmetteurs, les souris ont été placées dans un paradigme d'exploration forcée et leur comportement a été filmé avant la quantification neurochimique post-mortem. Un défi important de cette thèse fut la manipulation d'un large nombre de données neurochimiques qui, au-delà de l'aspect quantitatif, permet une approche corrélative incorporant la théorie des graphes pour construire des réseaux de connectivité neurochimique. Cette nouvelle analyse a entraîné le développement d'un code accompagnant le lancement d'une base de données neurochimiques pour rendre accessible ces données. Les résultats montrent qu'il est possible de mesurer plusieurs neurotransmetteurs par chromatographie liquide à haute pression et détection électrochimique dans 28 régions cérébrales appartenant à des réseaux neurobiologiques distincts. La densité des corrélations neurochimiques entre les régions cérébrales des animaux traités avec le solvant est très élevée, avec une organisation régionale remarquable pour la dopamine et la noradrénaline. Tant l'agoniste 5-HT2AR TCB-2 (0,3, 3 et 10 mg/kg) que l'antagoniste 5-HT2AR MDL-100,907 (0,2 mg/kg) réduisent le nombre de corrélations et perturbent l'organisation cérébrale des corrélations pour tous les neurotransmetteurs. Certains effets du TCB-2, notamment sur des paramètres sérotoninergiques dans plusieurs régions, sont indépendants des 5-HT2AR. D'autres effets, incluant des paramètres comportementaux (secousses de la tête, composantes du comportement exploratoire) et neurochimiques (monoamines dans le cortex cingulaire antérieur), sont réduits par le MDL-100,907. Le MDL-100,907 seul n'a que peu d'effets comportementaux et neurochimiques. Dans l'ensemble, la thèse montre que les 5-HT2ARs jouent un rôle important dans l'organisation de la cohérence des systèmes de neurotransmetteurs en réponse à un comportement exploratoire forcé, qu'elle soit ou non associée à des changements quantitatifs des neurotransmetteurs. La thèse offre un nouveau paradigme pour aborder la fonction des systèmes de neurotransmetteurs. Elle élargit la compréhension du mécanisme des psychédéliques dans le cerveau en incluant les territoires cérébraux (sensoriels, moteurs, cognitifs) avec certains effets latéralisés, et la connectivité altérée des systèmes de neurotransmission.